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牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

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詳細介紹

牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法

【產品名稱】

通用名稱:牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

 

【包裝規格】50T/盒

                                                                    

【預期用途】

牛傳染性胸膜肺炎又稱牛肺疫,是由絲狀支原體引起的一種急性或慢性、接觸性傳染病。以肺小葉間淋巴管漿液性炎癥,小葉間組織漿液性纖維素性浸潤,肺實質纖維蛋白性壞死性炎癥,繼以患病肺部出現貧血性壞死,常伴有漿液性、纖維素性胸膜炎為特征。本試劑盒適用于檢測呼吸道、肺部等樣本中的牛肺炎,用于牛肺炎感染的輔助診斷。

 

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術,設計一對牛肺炎特異性引物,結合一條特異性探針,用熒光PCR技術對牛肺炎的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

 

【試劑組成】

名      稱

  規      格

CBP酶液

       25μL×1管

CBP反應液

      975uL×1管

CBP陽性質控品

      50μL ×1管

陰性質控品

     50μL ×1管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

 

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融不超過5次,有效期12個月。

 

適用儀器

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

 

【標本采集】

    疑似患病牲畜取呼吸道樣本或胸、肺部樣本進行檢測。

 

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標本運送應采用2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。

 

使用方法

1. 樣品處理(樣本處理區)

1.1 樣本前處理

組織樣品:每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;分泌液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中

 

1.2 DNA提取

為了使實驗結果穩定、有效、可靠,建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進行提取,嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。

 

2. 試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應體系配制如下表:

試劑

CBP反應液

酶液

用量(樣本數為N)

19.5μL

0.5μL

 

3. 加樣(樣本處理區)

將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

 

4. PCR擴增(核酸擴增區)

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內;

4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM檢測牛肺炎,淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環參數設置:

步驟

循環數

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

3min

2

40 cycles

95

15sec

55℃

30sec

 

 

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。

 

5.2 結果判斷

陽性:檢測通道Ct值≤35.0,且曲線有明顯的指數增長曲線。

可疑檢測通道35.0<Ct值<38.0,且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結果出現Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性,否則為陰性。

陰性:樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

 

6. 檢測方法的局限性

樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

 

7. 質控標準

陰性質控品:無明顯擴增曲線且無Ct值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且Ct值≤30

以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

 

8. 性能指標

(1)敏感性:內控樣本敏感性為100%,綜合評價敏感性98%以上。最DI檢測限不低于1000copies/ml。

(2)特異性:100%。

(3)穩定性:批內及批間差異≤3%。

 

注意事項

所有操作嚴格按照說明書進行;

試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完全混勻并短暫離心;

反應液應避光保存;

反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理

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實驗技術服務:

 



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